Agrodom93.ru

Агропромышленный комплекс
3 просмотров
Рейтинг статьи
1 звезда2 звезды3 звезды4 звезды5 звезд
Загрузка...

На искусственных питательных средах можно выращивать

Культивирование бактерий

Бактерии выращивают на естественных и искусственных пита­тельных средах. Естественные среды (молоко, сусло-агар, сиро­пы и др.) имеют несбалансированное соотношение компонен­тов, их состав полностью не изучен. Искусственные питатель­ные среды включают вещества в строго определенных соотно­шениях с учетом потребностей данного вида в питательных веществах, ростовых добавках, солях и т.п.

Питательные среды должны быть стерильными и иметь, помимо необходимых для роста бактерий компонентов, опти­мальные значения рН, окислительно-восстановительного потен­циала, осмотического давления и т.д. Среды различаются в зависимости от консистенции, состава и назначения: по кон­систенции — плотные, полужидкие и жидкие; по составу — простые, сложные органические и синтетические (искусствен­ные); по назначению — специальные, элективные и дифферен­циально-диагностические.

Основой плотной питательной среды являются гелеобразные вещества: агар-агар (2—3 %), желатин (10—15 %) и др. Эти компоненты добавляют к жидким питательным средам, напри­мер, к мясопептонному бульону (МПБ), получая таким образом мясопептонный агар (МПА). Эти простые питательные среды применяют для выращивания многих бактерий. Сложные пита­тельные среды включают дополнительные компоненты — сы­воротку крови (сывороточный агар), кровь (кровяной агар), сахар (сахарный бульон) и т.д. Их используют для выявления свойств бактерий, т.е. это специальные питательные среды. Например, на кровяном агаре бактерии, продуцирующие гемолизин, обра­зуют колонии с зоной гемолиза.

Определенные виды бактерий выделяют, используя элективные (избирательные) среды. Например, элективной средой для стафилококков является желточно-солевой агар (ЖСА), для холерного вибриона — щелочный МПА, для дифтерийной палочки — свернутая сыворотка.

Для выделения некоторых бактерий, рост которых может подавляться сопутствующими микробами, используют среды обогащения. Так, для выделения сальмонелл и шигелл из фе­калий применяют селенитовый бульон, подавляющий рост сопутствующей микрофлоры — кишечной палочки.

Дифференциально-диагностические среды (Гисса, Эндо, Левина, Плоскирева и др.) предназначаются для дифференци­рования бактерий. Они содержат индикатор, меняющий свой цвет при изменении рН в результате расщепления ферментами углеводов питательных сред.

Имеются питательные среды, сочетающие свойства диффе­ренциально-диагностических и других питательных сред. Так, с помощью среды Плоскирева (как и среды Эндо) можно отли­чить кишечную палочку от дизентерийной по их действию на лактозу. Кишечная палочка, расщепляя лактозу с кислотообразованием, при росте дает колонии красного цвета (цвет инди­катора) в отличие от дизентерийной палочки, не расщепляю­щей лактозу. Наличие же в среде Плоскирева солей желчных кислот способствует преимущественному росту дизентерийной палочки, а бриллиантового зеленого — ведет к подавлению сопутствующих грамположительных бактерий.

Большинство патогенных и условно-патогенных бактерий растет в термостате при температуре 37 °С. Рост на питательных средах обычно учитывают через сутки после посева. Рост неко­торых возбудителей (туберкулеза, бруцеллеза) становится види­мым через 15—30 дней. Скорость роста бактерий зависит от их биологических свойств и условий культивирования (температу­ра, наличие или отсутствие кислорода, углекислого газа, дав­ление и др.). Аэрация способствует ускоренному росту аэробов. «встряхиватели». Для культивирования анаэробов применяют специальные пита­тельные среды (среда Китта—Тароцци, тиогликолевая среда, связывающие кислород), которые перед посевом кипятят для удаления растворенного кислорода.

Применяют также физические, химические и биологичес­кие методы культивирования анаэробов. Физический метод зак­лючается в удалении из аппарата или эксикатора воздуха и замене его газовой бескислородной смесью. Химический метод основан на применении химических поглотителей кислорода. Биологический метод Фортнера предусматривает одновремен­ный посев на одну половину чашки Петри аэробных инадругую половину — анаэробных бактерий,после чего чашку с посевом герметизируют парафином. При этом аэробы, исполь­зуя при своем росте кислород, создают условия для дальней­шего роста анаэробов.

Выросшие на питательных средах бактерии идентифицируют по типу колоний на твердых питательных средах и характеру роста на жидких питательных средах. На жидких средах бактерии образуют пленку на поверхности среды, наблюдается придон­ный рост или равномерное помутнение среды.

Дата добавления: 2015-06-12 ; просмотров: 1809 ; ЗАКАЗАТЬ НАПИСАНИЕ РАБОТЫ

1. Культивирование микробов на искусственных питательных средах. Свойства и состав искусственных питательных сред. Классификация искусственных питательных сред по назначению.

Питательной средой называют среды, содержащие различные соединения сложного или простого состава, которые применяются для размножения микроорганизмов в лабораторных или промышленных условиях.

Любая питательная среда должна отвечать следующим требованиям:

содержать все необходимые для размножения определённых микробов вещества в легкоусвояемой форме (источники углерода, азота, кислорода, водорода, неорганические соединения, факторы роста),

иметь оптимальные влажность, вязкость, pH,

быть изотоничной и по возможности прозрачной.

По назначению выделяют искусственные питательные среды:

• Элективные (селективные) – на которых лучше растёт какой-то определённый микроорганизм (напр., висмут-сульфитный агар для рода Salmonella)

• Среды обогащения – стимулируют рост какого-то определённого микроорганизма, ингибируя рост других (напр., среда, содержащая селенит натрия, таурохолевокислый натрий и бриллиантовый зелёный, стимулирует рост родаSalmonella и ингибирует рост E. Coli)

• Дифференциально-диагностические — для изучения и идентификации отдельных групп, видов бактерий, биоваров (напр., среды Левина, Плоскирёва – для диагностики дизентерии, род Shigella, от других представителей кишечной группы)

• Консервирующие – для сохранения патогенных микроорганизмов живыми в клиническом материале при их пересылке.

2. Клеточный иммунный ответ: спонтанный, индуцированный, гзт. Медиаторы и эффекторные реакции клеточного иммунного ответа.

Клеточный иммунный ответ подразумевает формирование клона лимфоцитов (К-лимфоциты, цитотоксические лимфоциты), способных разрушать клетки мишени, мембраны которых содержат чужеродные материалы (например, вирусные белки).

В отличие от гуморального иммунитета кот осущ-ся при помощи АТ, клеточный иммунитет подразумевает защиту организма при помощи клеток иммунной системы. Клеточный иммунитет обеспечивает сзащиту 3мя основными способами: 1)активируя антиген-специфические Т-лимф., кот распознают и уничтожают чужеродные АГ. 2)активируя макрофаги и Т-киллеры, кот разрушают внутриклеточные патогенны. 3)стим. секрецию цитокинов, кот обеспечивают согласованную реакцию различных клеток иммунной системы.

Клеточный иммунный ответ направлен в основном против микроорганизмов невосприимчивых к действию фагоцитов или поражающих другие клетки (вирусов, внутриклеточных грибов), а также против опухолевых клеток. Большое значение имеет в реакциях отторжения тканей.

1. Микрофлора воздуха. Источники и пути попадания патогенных микробов в воздух. Санитарно- показательные микробы воздуха. Методы санитарно-бактериологической оценки воздуха.

Воздух как среда обитания менее благоприятна для микрооргнизмов, чем почва и вода, т.к. в нем не содержится или мало содержится питательных веществ. Состав микрофлоры воздуха зависит от микрофлоры почвы и воды, а также от времени года и метеорологических условий. Видовой состав микробов довольно разнообразен. Чаще всего это спороносные микробы, а также сарцины, дрожжи, пигментообразующие бактерии, актиномицеты и плесневые грибы. Распространение патогенных и условно-патогенных бактерий воздушным путём связано с их устойчивостью к высушиванию. Патогенные микроорганизмы попадают в воздух из мокроты и слюны при кашле, разговоре и чихании. Таким воздушно-капельным путем происходит заражение многими острыми репираторными заболеваниями, гриппом, корью, коклюшем, дифтерией, легочной чумой. Также распространение может осуществляться «пылевым» путем. Когда выделение больного высыхает образуются частички пыли с микроорганизмами, потоками воздуха они могут разноситься. Пылевой способ играет особую роль в эпидемиологии туберкулеза, дифтерии, туляремии и др. заболеваний. Санитарно-бактериологическая оценка воздуха: микробное число – количество микробов в 1 куб.метре воздуха. Для определения микробного числа воздуха изпользуют метод Коха (чашечный или седиментационный), так же используют метод Кротова ( аспирационный мотор в аппарате Кротова крутится с определенной скоростью и засасывает воздух сквозь щель на чашку Петри, при этом происходит посев микробов. Затем подсчитывают число колоний), и метод Дьяконова ( пропускают воздух через стерильный физ.раствор, затем засевают 1 мл р-ра на чашку Петри ии ставят в термостат, считают число колоний). Санитарно-показательные микробы воздуха: альфа и бетта стрептококк, золотистый стафилококк. Среда для посева – кровяной агар.

Статьи

Питательные среды

Культивирование, дифференциация и выделение отдельных видов микроорганизмов стало возможным лишь с применением питательных сред. Это особые субстанции, которые создают благоприятные условия для размножения и роста определенного вида микробов и грибов, то есть чистых культур, что открывает возможность изучения их свойств и влияния на организм.

Сегодня питательные среды применяются как в медицине, так и в иных областях, например, в пищевой промышленности, где используются различные виды микроорганизмов для улучшения качества продуктов питания, увеличения срока годности, вкусовых и ароматических свойств. Так, чистые культуры, выделенные посредством использования питательных сред, применяются на хлебобулочных производствах, в винно-водочной промышленности, при создании сыров и молочных продуктов, для получения органических кислот, при квашении и консервации овощей и фруктов, в фармакологии.

Однако большая часть микробиологических исследований приходится на медицинский сектор. Именно поэтому основным покупателем субстратов являются клиники и лаборатории.

Компания БиоВитрум ведущий производитель и поставщик медицинского, диагностического и лабораторного оборудования, а также расходных материалов. Одно из направлений деятельности – это изготовление питательных сред для культивирования и выращивания микроорганизмов. Продукция компании производится из высококачественного сырья, которое содержит компоненты лошадиной и бараньей крови. Преимуществом, поставляемого из Великобритании исходного материала, являются особые условия, в которых выращивают животных. Их корма не содержат антибиотиков, что гарантирует стерильность питательных сред.

БиоВитрум предлагает купить питательные среды всех типов, которые соответствуют европейским стандартам.

Требования, предъявляемые к средам

Производимые сегодня субстраты, применяемые в целях культивирования, дифференциации и выделения микроорганизмов, должны соответствовать определенным показателям:

  • Питательность. Среда обладает жизненно важными для питания и удовлетворения энергетических потребностей, выращиваемых культур. А именно, содержит витамины, минеральные и органические (натуральные) вещества, микроэлементы, входящие в клеточный состав и активизирующие выработку ферментов и не вырабатываемые естественным путем аминокислоты.
  • Наличие водородных ионов. Поскольку микроорганизмы способны питаться только при условии проницаемости клеточной оболочки, то для ее обеспечения необходим оптимальный pH баланс.

Для патогенных микробов нужна слабощелочная питательная среда, для возбудителей туберкулеза пригодной является слабокислотная реакция.

  • Буферность среды. Это свойство обеспечивает стабильность pH баланса, нейтрализуя продукты распада.
  • Изотоничность – показатель давления внутри клетки и в среде, который должен находиться на одинаковом уровне для большинства микроорганизмов.
  • Стерильность среды. Важно исключить наличие посторонних микробов, которые способны оказать влияние на рост интересующей культуры.

Среды должны иметь влажность, поэтому плотные и сухие среды требуют предварительной подготовки. Среды должны обладать окислительно-восстановительными характеристиками, прозрачностью. Такой показатель, как унифицированность обеспечивает возможность выращивания различных микроорганизмов.

Классификация

Каждая культура нуждается в определенных условиях для обильного размножения клеток, их интенсивного роста и оптимального развития, поэтому сложно создать универсальную среду. Помимо этого, в зависимости от целей проводимых исследований, изменяются параметры питательной среды.

Сегодня созданы несколько разновидностей сред, отличающихся свойствами:

  • По составу исходных компонентов их классифицируют на синтетические и натуральные. Последние изготовляются из растительного либо животного сырья. Для снижения себестоимости используются непищевые продукты, например, костную муку или сгустки свернувшейся крови. Синтетические получают из органических, то есть натуральных и минеральных компонентов.
  • По консистенции Среды делятся на жидкие, плотные, полужидкие. Увеличение густоты осуществляется посредством добавления желатина или агар-агара. Последний ингредиент не является для микробов питательным веществом, его задача состоит в создании оптимальной плотности. При этом температура плавления агара достигает 80-100 градусов, что позволяет выращивать на средах с его содержанием микроорганизмы, нуждающиеся в создании парниковых условий. Желатин же представляет собой животный белок, поэтому субстраты с его содержанием можно применять в условиях комнатной температуры. К плотным субстанциям относят свернувшуюся сыворотку крови, яичный белок, картофель. Некоторые производятся в виде порошков и требуют перед употреблением растворения и доведения до нужной консистенции.
  • Состав питательных сред бывает простым и сложным. Первые представляют собой мясопептоидные бульоны, питательный желатин, пептоидные воды. Второй тип, кроме исходных компонентов, включает вещества, способствующие росту тех или иных бактерий. Существуют и специальные среды, используемые там, где не возможен рост бактерий на обычной субстанции.
  • Элективные питательные среды. Применяются для выделения конкретного типа бактерий за счет подавления роста других. Жидкие среды этой категории называют накопительными.
  • Дифференциально-диагностические среды используют для выделения одной культуры по ее ферментативной активности. Консервирующие субстраты используются при транспортировке материалов к месту исследования.

Приготовление сред

От качества питательной среды зависит точность полученных результатов, поэтому кроме соблюдения рецептуры, необходимо придерживаться следующих требований:

  • Стерильность посуды. В производственных условиях, где изготовление осуществляется масштабно, варка сред проводится в специальных котлах. В лабораториях, когда необходимо получить небольшое количество питательных сред следует использовать эмалированную или стеклянную посуду, которая не выделяет кислоты и щелочи. Предварительно все резервуары моют, прополаскиваю и высушивают.
  • Ранее не использованная стеклянная посуда подвергает стерилизации в хлороводородистой кислоте, в которой оставляется на ночь, после чего прополаскивается в соответствии с установленным режимом.

Сам процесс приготовления питательных сред состоит из следующих этапов:

  • Варка, которая осуществляется либо на огне и водяной бане (для лабораторных условий), либо в котлах и автоклавах с подачей пара (в промышленных масштабах).
  • Установка оптимального pH соотношения требует использования бумажных индикаторов, потенциометров, стеклянных электродов.
  • Осветление осуществляется при помощи введения в субстрат, взбитого с водой, яичного белка или кровяной сыворотки, которые в процессе варки увлекают в осадок взвешенные частицы.
  • Фильтрации подвергаются жидкие среды, и на основе расплавленного желатина. Для этого используют тканевые и бумажные увлажненные фильтры. Существенно затрудняется очистка агаровых субстратов, поскольку основной компонент быстро застывает. Поэтому этот процесс чаще заменяется отстаиванием.
  • Стерилизация осуществляется для каждого субстрата в определенный промежуток времени и при необходимой температуре. Эти параметры указаны рецептуре приготовления.

Завершающим этапом является расфасовка питательных сред в посуду – это флаконы, пробирки, чашки Петри. Сосуд заполняется только на 2/3 поскольку при стерилизации среда увеличивается в объеме и может достичь пробки, что повлияет на чистоту и свойства субстрата.

Разливается продукт с использованием воронок, шприцев, пипеток или иных приспособлений.

Каждый сосуд маркируется. На сосуды наносится название продукта, указывается количество и дата производства.

Готовая среда проходит несколько ступеней контроля. Первые испытания на стерильность осуществляются путем помещения продукции в термостат.

Птательная среда отправляется в лаборатории для проведения химических испытаний, целью которого является установление точного pH уровня.

Проводится биологический контроль, который заключается в определении питательных качеств среды.

Виды питательных сред

По своему назначению производимые сегодня питательные составы среды можно разделить на следующие категории:

  • Универсальные среды. Они подходят для размножения различного типа культур.
  • Селективные или избирательные среды. Используются для выделения одного вида микроорганизмов.
  • Дифференциально-диагностические среды, которые открывают возможность отличить бактерии по их ферментативным свойствам, то есть продуктам жизнедеятельности.
  • Специальные среды. Применяются для выращивания тех культур, которые неспособны размножаться на универсальных субстратах.
  • Дифференциально-селективные средыиспользуются для оперативной идентификации бактерий.
  • Полусинтетические питательные составы среды, в состав которых вводят компоненты природного происхождения.

Компания БиоВитрум предлагает широкий ассортимент питательных сред, которые поставляют как во флаконах различного объема, так и в готовом виде в чашках Петри. Последние закупориваются специально разработанной целлюлозной пленкой, которая обеспечивает стерильность среды и срок годности, достигающий 60 дней.

Преимуществом компании БиоВитрум является оперативность поставок, конкурентоспособные цены, соответствие стандартам ГОСТ. Все питательные составы среды изготовляются на собственных мощностях, оснащенных высокотехнологичным оборудованием из сырья Oxoid LTD известного производителя Великобритании.

В компании БиоВитрум можно приобрести 18 наименований продуктов, представленных в каталоге, которые проходя многоступенчатый контроль. Продукция поставляется с полным комплектом документации и маркировкой на русском языке.

На искусственных питательных средах можно выращивать

1. Основные принципы и условия культивирования бактерий. Питательные среды, их классификация. Требования, предъявляемые к питательным средам. Особенности культивирования грибов и простейших.

Культивирование микроорганизмов является одним из основных методов микробиологии. От умения культивировать микроорганизмы в лабораторных условиях в значительной степени зависят успехи их изучения и практического применения. Культивирование основано на знании физиолого-биохимических особенностей микроорганизмов и понимании значения физико-химических условий среды, необходимых для их жизнедеятельности. В лабораторных условиях микроорганизмы культивируют на питательных средах.

Условия культивирования микроорганизмов

Для роста микроорганизмов существенное значение имеет состав питательной среды, кислотность среды, аэрация, температура, свет, влажность. Развитие микроорганизмов возможно лишь в определенных пределах каждого фактора, причем для различных групп микроорганизмов эти пределы часто неодинаковы.

Большинство бактерий лучше всего растут при рН, близком к 7,0. Микроскопические (плесневые и дрожжевые) грибы предпочитают слабокислые среды. В случае необходимости кислотность среды доводят до нужного значения растворами кислот, щелочей или солей, имеющих кислотную реакцию (Na2CO3, NaHCO3). Активная кислотность питательной среды, благоприятная для начала роста микроорганизмов, часто меняется в процессе культивирования микроорганизмов. Эти изменения могут быть результатом образования продуктов метаболизма или неравномерного потребления отдельных компонентов среды. Чтобы избежать этого, в среды добавляют буферные растворы (чаще фосфатные) или избыточное количество мела.

Аэрация. Кислород входит в состав воды и многих соединений, поэтому поступает в клетки всегда в больших количествах. Однако значительная часть микроорганизмов нуждается в постоянном притоке молекулярного кислорода (группа облигатных аэробов). Развитие других микроорганизмов, напротив, возможно только в отсутствие кислорода (облигатные анаэробы). Существует также переходные группы микроорганизмов по потребности в кислороде.

Для выращивания аэробных форм микроорганизмов чаще всего используется метод поверхностного культивирования на плотных и жидких питательных средах. Питательные среды разливают тонким слоем в посуду с широким дном, обычно в чашки Петри. Для получения аэробного роста в большом объеме жидкой среды требуется дополнительная аэрация. Для этого используются различные устройства, обеспечивающие постоянное перемешивание среды путем встряхивания или вращения сосудов. Можно пропускать стерилизованный воздух через жидкость под давлением с помощью пористых разбрызгивателей или обеспечивать механическое перемешивание специальными механизмами.

Для роста строго анаэробных микроорганизмов нужно исключить попадание кислорода в среду инкубации. Для этого среды перед посевом кипятят, посевы выдерживают в герметически закрытых сосудах или в специальных вакуумных анаэростатах, из которых с помощью насосов выкачивается воздух, или воздух в них заменяется каким-нибудь инертным газом (например, азотом). В анаэростат можно добавлять различные вещества, поглощающие кислород – щелочной пирогаллол, хлорид одновалентной меди и др. Кроме того используют разные приёмы: выращивание в высоком слое среды; культивирование в вязких средах; выращивание в толще плотной среды.

Читать еще:  Выгодно ли выращивать индюков и какая выгода по деньгам

При культивировании автотрофных микроорганизмов, использующих в качестве источника углерода углекислый газ, добавляют в среду NaHCO3.

Температура. Интервал температур, в которых возможен рост различных микроорганизмов, заметно варьируется. У мезофилов, к которым относится большинство известных нам микроорганизмов, температурный оптимум лежит в интервале от 25 до 37ºС. У термофилов он значительно выше: от 45 до 80–90ºС. Психрофилы хорошо развиваются в интервале температур 5–10ºС. Отклонения температуры от оптимальной неблагоприятно влияют на развитие микроорганизмов. Поэтому микроорганизмы выращивают в термостатах или специальных термостатированных комнатах, где с помощью терморегуляторов поддерживается соответствующая температура. Для выращивания психрофилов используют холодильные камеры.

Вода. Рост микроорганизмов невозможен без присутствия в окружающей среде воды, причём вода должна находиться в доступной для клетки форме, то есть в жидкой фазе. Однако в природных субстратах и питательных средах часть воды ассоциирована с молекулами растворённых веществ и не может быть использована микроорганизмами. Различную активность воды в питательной среде создают добавлением к ним таких соединений, как NaCl, KCl, глюкоза, глицерин, полиэтиленгликоль.

Пищевые потребности микроорганизмов и требования

к питательным средам:

Для выделения, выращивания и длительного сохранения микроорганизмов в культурах используют различные питательные среды, содержащие все вещества, необходимые для их роста. Конструктивные и энергетические процессы у микроорганизмов крайне разнообразны, поэтому столь же разнообразны их потребности в питательных веществах. Однако выделяют основные группы необходимых питательных веществ.

1. Источники углерода. По потребности в углероде микроорганизмы принято делить на автотрофы и гетеротрофы. Автотрофные микроорганизмы способны в качестве единственного источника углерода использовать углекислый газ. Для культивирования автотрофов в среды вносят бикарбонат натрия или карбонаты. В некоторых случаях через среду продувают воздух, обогащённый 1–5 % углекислого газа. Для культивирования гетеротрофов среда должна содержать органические вещества – кислоты, спирты, углеводы, углеводороды, ароматические соединения.

2. Источники азота. Потребности микроорганизмов в источнике азота могут быть удовлетворены различными азотсодержащими соединениями. Для очень многих микробов это могут быть неорганические соединения – соли аммония, нитраты. Потребности других микроорганизмов в азоте удовлетворяют, добавляя к среде гидролизат белка или аминокислоты. Наиболее требовательные микроорганизмы культивируют на питательных средах, содержащих белки или продукты их неполного расщепления – пептоны, представляющие собой смесь поли- и олигопептидов, аминокислот, органических азотистых оснований, солей и микроэлементов. Пептоны получают в результате воздействия протеолитических ферментов на белки животного или растительного происхождения.

3. Минеральные соли. Микроорганизмам для построения веществ клетки кроме углерода и азота необходимы также сера, фосфор и ряд других элементов. Все они должны содержаться в среде в доступной форме. Потребности в этих элементах обычно удовлетворяются за счёт минеральных солей – сульфатов, фосфатов и хлоридов магния, кальция, натрия, железа и др.

4. Микроэлементы. Потребности микроорганизмов в микроэлементах (марганец, молибден, цинк, медь, кобальт) очень малы. Питательные среды с пептоном, почвенной вытяжкой, дрожжевым экстрактом, гидролизатом казеина содержат необходимые микроэлементы. В состав синтетических сред микроэлементы необходимо дополнительно вносить.

5. Факторы роста. Многие микроорганизмы требуют наличия в среде так называемых факторов роста, к которым относятся витамины, аминокислоты, пуриновые и пиримидиновые основания. Чтобы подчеркнуть потребность микробов в факторах роста, принято использовать термины прототрофы и ауксотрофы. Прототрофы не нуждаются в факторах роста, для ауксотрофов абсолютно необходимо наличие в среде одного или несколько факторов роста. Примерами смесей, содержащих различные факторы роста, могут служить дрожжевой экстракт, дрожжевой автолизат, кукурузный экстракт.

Существует ряд требований, предъявляемых к питательным средам:

1. среды должны содержать полный набор необходимых питательных веществ;

2. среды должны быть изотоничными (для большинства микроорганиз-мов концентрация солей не должна превышать 0,5 %);

3. кислотность среды должна быть нейтральной или слабощелочной (pН=6–8). В процессе культивирования микроорганизмов в среду могут выделяться метаболиты, изменяющие рН среды настолько, что рост микроорганизмов существенно замедляется или даже становится невозможным. Чтобы избежать изменения рН, в среду добавляют буферные системы, чаще фосфатные (они малотоксичны для микроорганизмов и используются ими также в качестве источника фосфора);

ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ

Питательные среды — искусственные субстраты, представляющие собой сбалансированную смесь питательных веществ в концентрациях и сочетаниях, создающих наилучшие условия для роста микроорганизмов.

Питательные среды используют для культивирования микроорганизмов в лабораторной и производственной практике, для изучения свойств микроорганизмов, выделенных из организма (при диагностике инфекционных болезней) или из окружающей среды, для хранения и консервации чистых культур микроорганизмов. Питательные вещества, входящие в состав Питательных сред, необходимы для биосинтеза структурных и биохимических компонентов микроорганизмов и для получения ими энергии. Все химические реакции в живых организмах протекают в водной среде, поэтому вода — важный компонент любой П. с. и выполняет в ней роль источника кислорода и водорода.

Наилучший источник углерода для микроорганизмов — углеводы. Моносахариды, особенно гексозы, широко используются многими микроорганизмами. Одним из наиболее широко потребляемых микроорганизмами углеводов является глюкоза. Хороший источник углерода для многих грибков и актиномицет — маннит. Актиномицеты способны использовать как источник углерода глицерин. Органические к-ты также служат источником углерода, однако они могут привести к снижению pH среды и затормозить рост микроорганизмов, поэтому чаще применяют соли органических к-т. Нек-рые органические к-ты (лимонная, винная) вызывают в П. с. недостаток ионов металлов, что также влияет на рост микроорганизмов. Аминокислоты служат хорошим источником углерода и обеспечивают потребности микроорганизмов в нем. В качестве источника углерода разные микроорганизмы могут использовать различные соединения. Так, напр., нек-рые бактерии рода Pseudomonas способны использовать в качестве источника углерода и энергии любое из 90 различных органических соединений, включая сахара, жирные к-ты, органические к-ты и аминокислоты, а бактерии, окисляющие метан, утилизируют в качестве источника углерода и энергии только метан и метанол.

В Питательных средах должен быть доступный для микроорганизмов источник азота, который нужен для синтеза аминокислот, необходимых при построении клеточных белков, для синтеза пуриновых и пиримидиновых оснований — структурных элементов нуклеиновых к-т. В качестве источника азота грибки и нек-рые бактерии используют нитраты, к-рые сначала восстанавливаются микроорганизмами и только после этого используются в процессах биосинтеза. Очень многие микроорганизмы нуждаются в восстановленном азоте, поэтому для их культивирования в П. с. в качестве источника азота вносят соли аммония. Потребность микроорганизмов в азоте может быть удовлетворена за счет органических соединений, напр, аминокислот, или более сложных продуктов неполного распада белков-пептонов. Эти соединения могут служить источником не только азота, но и углерода, серы, а также энергии. Поэтому П. с., содержащие в качестве субстрата белки животного или растительного происхождения или продукты их химического или ферментативного расщепления, обеспечивают рост и развитие подавляющего большинства микроорганизмов.

Фосфор необходим микроорганизмам для синтеза ряда важнейших компонентов клетки (ДНК, РНК, АТФ и пр.). Источником фосфора в П. с. могут быть фосфаты. Источником фосфатов в естественных средах (бульонах) являются нуклеиновые к-ты или продукты их расщепления (олигонуклеотиды, нуклеотиды).

В качестве источника серы в П. с. вносят сульфаты, а в питательных средах, приготовленных из белков естественного происхождения или продуктов их распада, источником серы служат нек-рые аминокислоты (цистин, цистеин).

В Питательных средах должны находиться минеральные соединения. Потребность микроорганизмов в минеральных элементах различна. В П. с. добавляют минеральные вещества — калий, магний, кальций, а также микроэлементы — железо, кобальт, медь, молибден, цинк, марганец. Функция минеральных соединений в метаболизме микроорганизмов сводится в основном к активации ферментов.

Для ряда бактерий — представителей родов Haemophilus, Corynebacterium, Lactobacillus, Brucella и некоторых других — требуется наличие в П. с. факторов роста (см. Бактериальные факторы роста), т. е. соединений, необходимых для жизнедеятельности микроорганизмов, но не синтезируемых ими. К числу таких веществ относятся аминокислоты, витамины, пуриновые и пиримидиновые основания и др.

Одним из важных факторов, определяющих качество П. с., является оптимальная концентрация водородных ионов, оцениваемая показателем pH, и сохранение реакции среды в оптимальном диапазоне для данного микроорганизма при его культивировании. Предельные значения pH среды для микроорганизмов 4,0— 9,0, чаще всего оптимум pH близок к нейтральному. Патогенные микроорганизмы лучше растут на средах, pH которых 7,2—7,4, а грибки — при pH 4,0—6,0. Бактерии не растут на средах, pH которых ниже 4,0. Исключением являются уксуснокислые бактерии и серные бактерии, окисляющие серу до серной к-ты.

Метаболическая активность культивируемых микроорганизмов может привести к сдвигу реакции среды как в кислую, так и в щелочную сторону. Чтобы не допустить этого, в П. с. добавляют буферы. Чаще всего при приготовлении П. с. используют фосфатные буферы, состоящие из смеси однозамещенного и двузамещенного фосфатов (K2HPO4 и KH2PO4). Максимальная концентрация фосфата в среде, переносимая бактериями и грибками, соответствует 0,5%.

Питательные среды в зависимости от их свойств и назначения можно разделить на группы. По консистенции их делят на плотные, жидкие и полужидкие. Был предложен ряд веществ, уплотняющих П. с. (метил целлюлоза, крахмальный гель и др.). Практическое использование нашли агар — полисахарид, выделяемый из морских водорослей (см. Агар), желатина (см.) и силикагель, представляющий собой двуокись кремния. Агар обычно вносят в П. с. в концентрации 1—2%, желатину — 10—15%, а силикагель — 1,5% . Среды с желатиной используют лишь в специальных целях, т. к. желатиновый гель плавится при t° 25—30°, т. е. ниже оптимума роста большинства патогенных бактерий. В полужидких средах концентрацию агара снижают до 0,2-0,4%.

По характеру ингредиентов, входящих в состав П. с., их делят на П. с. неизвестного хим. состава, основанные на белках и продуктах их гидролиза, и среды известного состава (синтетические среды). П. с. неизвестного хим. состава могут быть простыми (основными) и сложными. Основные ингредиенты простых П. с.— продукты распада белков, полученные путем ферментативного или кислотного гидролиза. Ферментативный гидролиз осуществляют с помощью частично очищенных протеолитических ферментов (пепсина, трипсина, папаина) или путем обработки исходного сырья (мяса, рыбы, плаценты) тканями, содержащими эти ферменты, напр, поджелудочной железой, измельченными свиными желудками (см. Мартена бульон, Хоттингера агар). Обработка ферментами животных белков не сопровождается их полным гидролизом, в результате чего образуются так наз. пептоны (см.). На П. с., содержащих пептоны, микроорганизмы размножаются лучше, чем на полных гидролизатах белка или на смесях аминокислот, т. к. при ферментативном гидролизе животных или растительных тканей в них сохраняются лабильные факторы роста. О степени гидролиза белков в исходном полуфабрикате судят по содержанию в нем общего и аминного азота. Напр., в мясном переваре по Хоттингеру количество общего азота равно 1100—1200 мг/100 мл, количество аминного азота 650— 700 мг/100 мл, что соответствует расщеплению белка, равному 55—60%. Для роста микроорганизмов необходимо, чтобы в 100 мл бульона содержалось 250—300 мг общего азота, из которого 25—30% составляет аминный азот.

На основе простых Питательных сред готовят сложные, напр, среды, содержащие различные сахара (сахарный бульон, сахарный агар) или кровь (см. Борде — Жангу питательная среда, Левинталя среды, Файлдса среда, Цейсслера среда). К числу сложных П. с. натурального происхождения относят среды, содержащие сыворотку крови, и среды с добавлением асцитической жидкости. Напр., для выращивания кокков используют сывороточный агар, содержащий 10 или 20% сыворотки крови лошади или быка, или сывороточный бульон — мясо-пептонный бульон (см. Бульон мясо-пептонный) двойной концентрации, к к-рому добавлено 8—10% сыворотки крови. Нек-рые бактерии (менингококки, гонококки) лучше растут при наличии человеческого белка. Поэтому для их культивирования в П. с. вносят асцитическую жидкость. Асцит-бульон и асцит-агар готовят на основе простых П. с., к которым добавляют до 30% асцитической жидкости. К числу сложных П. с., приготовленных на основе простых сред, можно отнести молочные среды, яичные среды.

Все вышеперечисленные среды относятся к так наз. натуральным средам неизвестного состава, т. к. они содержат питательные субстраты естественного происхождения. Вместе с тем контроль за ростом и культивированием бактерий более эффективен, если использовать П. с. известного состава, содержащие воду и химически чистые соединения в определенных концентрациях. Такие среды называют синтетическими питательными средами (см.). Они имеют преимущество перед другими П. с. при изучении особенностей метаболизма микроорганизмов, т. к. дают возможность исследовать и оценивать метаболические реакции в зависимости от содержания в среде тех или иных компонентов. Сложность состава синтетических П. с. зависит от биосинтетической активности микроорганизмов, т. е. от их потребности в готовых факторах роста. Если для роста бактерий необходимы многие факторы роста, то синтетические П. с. весьма сложны по своему составу. Напр., для выращивания бактерий Leuconostoc mesenteroi-des требуется наличие в синтетической П. с. уксусной к-ты, 19 аминокислот, 4 пуринов и пиримидинов и 10 витаминов. Сложные П. с. готовят на основе минимальных П. с., в состав которых входит вода, минеральные соли, источник азота, чаще всего NH4Cl, и источник углерода и энергии, обычно глюкоза или другой легко усваиваемый углевод. К этой минимальной П. с. добавляют необходимые факторы роста. Напр., L-аминокислоты в количестве 10—20 мкг/мл. Следует учитывать, что D-изомеры аминокислот могут угнетать рост бактерий. Пурины, пиримидины, нуклеозиды и нуклеотиды обычно вносят в синтетические П. с. в конечной концентрации до 10 мкг/мл, витамины — ДО 1 мкг/мл.

По своему назначению П. с. делят на селективные (элективные) и дифференциально — диагностические. При использовании селективных П. с. можно отобрать выделяемый микроорганизм из смешанных культур или исследуемого материала путем создания условий, благоприятных для его культивирования и неблагоприятных для сопутствующих микроорганизмов других видов. Селективными П. с. являются, напр., щелочная пептонная вода и щелочный агар, на которых хорошо культивируются холерные вибрионы. Селективные условия иногда возникают в П. с. в результате метаболической активности выделяемого микроорганизма. Так, накопление молочнокислых бактерий осуществляют в среде, содержащей органический источник факторов роста и азота, напр, дрожжевой экстракт и глюкозу. После засева на такую среду полимикробного материала (сырое молоко, кусочки овощей, сточные воды) и инкубации при анаэробных условиях в П. с. постепенно накапливается молочная к-та. Среда интенсивно закисляется, что не мешает развитию молочнокислых бактерий, но угнетает (ингибирует) рост других бактерий, в частности бактерий сем. Enterobacteriaceae. В качестве П. с., селективных для патогенных представителей сем. Enterobacteriaceae, используют среды, содержащие желчь, желчный бульон (10— 20% желчи), среду Кауффманна (см. Кауффманна среда). Селективные условия для бактерий сем. Enterobacteriaceae создают также путем добавления в П. с. некоторых красителей: малахитового зеленого, бриллиантового зеленого, кристаллического фиолетового, метиленового синего и других, угнетающих рост грамположительных бактерий. В ряде случаев в качестве фактора прямой селекции бактерий, устойчивых к антибиотикам или другим противобактериальным средствам, в П. с. добавляют это вещество в концентрации, при которой клетки так наз. дикого типа погибают, а устойчивые особи сохраняются. Антибиотики используют в селективных П. с. не только для прямой селекции, но и для опосредованной. В качестве примера можно указать на жидкие синтетические П. с., к которым добавлен пенициллин или ампициллин. На этих средах можно отбирать любые ауксотрофные мутанты (см. Ауксотрофные микроорганизмы). Принципы «работы» этих сред основаны на способности антибиотиков подавлять рост размножающихся бактерий. Ауксотрофный мутант не растет в минимальной среде, поэтому он не погибает под влиянием указанных антибиотиков и его легко выделить затем на полноценных средах.

Широко распространены так наз. дифференциально-диагностические среды (см.), позволяющие выявить у микроорганизмов специфические особенности их обмена веществ и тем самым отдифференцировать выделенный микроорганизм от других родственных, но отличающихся своим метаболизмом (см. Левина среда, Расселла среда, Эндо среда). В целях стандартизации П. с., что необходимо для получения повторяющихся сравнимых результатов, широко используют сухие П. с., к-рые представляют собой высушенные до порошкообразного состояния П. с. различного состава. Широкую известность приобрели П. с., выпускаемые американской фирмой Дифко. Они используются как для культивирования различных микроорганизмов, так и для дифференциальной микробиологической диагностики. В СССР производят сухие Питательные среды для культивирования разнообразных микроорганизмов (сухой питательный бульон, сухой питательный агар), а также среды специального назначения, напр, для выращивания и выделения возбудителей бруцеллеза и туляремии, патогенных клостридий, дифтерийных бактерий, бактерий сем. Enterobacteriaceae, микобактерий и др.

Библиография: Козлов Ю. А. Питательные среды в медицинской микробиологии, М., 1950; Роуз Э. Химическая микробиология, пер. с англ., с. 65, М., 1971; Руководство по микробиологической диагностике инфекционных болезней, под ред. К. И. Матвеева, с. 270 и др., М., 1973; Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования, под ред. М. О. Биргера, с. 41, М., 1973; Стейниер Р., Эдельберг Э. и Ингрем Дж. Мир микробов, пер. с англ., т. 1, с. 46, М., 1979.

Методы культивирования анаэробов

Для культивирования анаэробов необходимо понизить окислительно-восстановительный потенциал среды, соз­дать условия анаэробиоза, т. е. пониженного содержания кислорода в сред окружающем ее пространстве. Это достигается применением физических, химических и би логических методов.

Физические методы.

Основаны на выращивании мик­роорганизмов в безвоздушной среде, что достигается:

1) посевом в среды, содержащие редуцирующие и легко окисляемые вещества;

2) посевом микроорганизмов в глубину плотных пи­тательных сред;

Читать еще:  Как выращивать сладкий перец в домашних условиях?

3) механическим удалением воздуха из сосудов, в ко­торых выращиваются анаэробные микроорганизмы;

4) заменой воздуха в сосудах каким-либо индиффе­рентным газом.

В качестве редуцирующих веществ обычно использу­ют кусочки (около 0,5 г) животных или растительных тканей (печень, мозг, почки, селезенка, кровь, картофель, вата). Эти ткани связывают растворенный в среде кис­лород и адсорбируют бактерии. Чтобы уменьшить содер­жание кислорода в питательной среде, ее перед посевом кипятят 10-15 мин, а затем быстро охлаждают и зали­вают сверху небольшим количеством стерильного вазе­линового масла. Высота слоя масла в пробирке около 1 см.

В качестве легко окисляемых веществ используют глю­козу , лактозу и муравьинокислый натрий.

Лучшей жидкой питательной средой с редуцирующи­ми веществами является среда Китта-Тароцци, кото­рая используется с успехом для накопления анаэробов при первичном посеве из исследуемого материала и для поддержания роста выделенной чистой культуры анаэ­робов.

Посев микроорганизмов в глубину плотных сред про­изводят по способу Виньяль-Вейона, который состоит в механической защите посевов анаэробов от кислорода воздуха. Берут стеклянную трубку длиной 30 см и диа­метром 3-6 мм. Один конец трубки вытягивают в ка­пилляр в виде пастеровской пипетки, а у другого конца делают перетяжку. В оставшийся широкий конец трубки вставляют ватную пробку.

В пробирки с расплавленным и охлажденным до 50°С питательным агаром засевают исследуемый материал. Затем насасывают засеянный агар в стерильные трубки Виньяль-Вейона. Капилляр­ный конец трубки запаивают в пламени горелки и трубки помещают в термостат. Так создаются благоприятные условия для роста самых строгих анаэробов. Для выде­ления отдельной колонии трубку надрезают напильни­ком, соблюдая правила асептики, на уровне колонии, ло­мают, а колонию захватывают стерильной петлей и переносят в пробирку с питательной средой для дальней­шего выращивания и изучения в чистом виде.

Удаление воздуха производят путем его механическо­го откачивания из специальных приборов — анаэростатов, в которые помещают чашки с посевом анаэробов. Переносный анаэростат представляет собой толстостен­ный металлический цилиндр с хорошо притертой крыш­кой (с резиновой прокладкой), снабженный отводящим краном и вакуумметром. После размещения засеянных чашек или пробирок воздух из анаэростата удаляют с помощью вакуумного насоса.

Замену воздуха индифферентным газом ( азотом , во­дородом , аргоном , углекислым газом) можно производить в тех же анаэростатах путем вытеснения его газом из баллона.

Химические методы.

Основаны на поглощении кисло­рода воздуха в герметически закрытом сосуде (анаэро-стате, эксикаторе) такими веществами, как пирогаллол или гидросульфит натрия Na2S204.

Биологические методы.

Основаны на совместном вы­ращивании анаэробов со строгими аэробами. Для этого из застывшей агаровой пластинки по диаметру чашки вырезают стерильным скальпелем полоску агара шири­ной около 1 см. Получается два агаровых полудиска в одной чашке. На одну сторону агаровой пластинки засе­вают аэроб, например часто используют S. aureus или Serratia marcescens. На другую сторону засевают ана­эроб. Края чашки заклеивают пластилином или заливают расплавленным парафином и помещают в термостат. При наличии подходящих условий в чашке начнут размно­жаться аэробы. После того, как весь кислород в прост­ранстве чашки будет ими использован, начнется рост анаэробов (через 3-4 сут). В целях сокращения воздуш­ного пространства в чашке питательную среду наливают возможно более толстым слоем.

Диев А.Б. Принципы микроклонального размножения. Адаптация меристемных растений.

Лекция в МОИП 4 марта 2015 года.
Диев А.Б., действительный член МОИП.

Конспект лекции:

Микроклональное размножение растений делится на два этапа – непосредственно размножение растительного материала in vitro (проводится в специализированной лаборатории) и последующая адаптация микроскопических растений (может проводиться любым желающим в домашних условиях).

Первый этап представляет из себя, образно говоря, «микрочеренкование» (массовое размножение при помощи «микрочеренков»). У растения срезают тонкий (0,8 мм) слой с верхушки почки, который содержит клетки верхушечной меристемы. Этот материал помещают на стерильную питательную среду на основе агара (среда в обязательном порядке содержит сахара, питательные элементы, а также в среды на разных этапах микроразмножения могут добавлять фитогормоны). Растительные клетки активно делятся, на питательной среде начинает формироваться маленькое растение – и через некоторое время у него снова срезают верхушечную меристему и переносят на новую питательную среду. Такие пересевы («пассажи») производят несколько раз, в результате растительные клетки адаптируют к развитию на искусственных питательных средах и одновременно снижается вероятность завирусованности растительного материала. Считается, что клетки апикальных меристем свободны от вирусов вследствие своих свойств свойств (т.к. распространение вирусов имеет свою скорость, даже в заражённом растении вирусы «не успевают» проникнуть в активно делящиеся меристематические клетки). В качестве дополнительных процедур возможны химические обработки от вирусов, но они всё-таки действуют на растительные ткани угнетающе.

Запускаемое в массовое размножение микроклональное растение должно быть свободно от вирусов, поэтому его проверяют молекулярно-генетическими методами на отсутствие заражённости. Тест на один вирус стоит порядка 500-700 рублей, набор проверяемых вирусов различен для разных культур. Так, малину тестируют на 5 вирусов. Убедившись в «чистоте» растительного образца, приступают к его массовому размножению. В питательную среду добавляют фитогормон, стимулирующий ветвление. С образующихся многочисленных боковых побегов срезают «микрочеренки» и помещают их на агаровую среду (все операции проводят в стерильных условиях, используя ламинарные шкафы). Технология массовая – за одну рабочую смену оператор делает до 800 микрочеренков. Далее – изменяют состав питательной среды, и меристемные растения начинают образовывать корни. Растения какое-то время подращивают (они находятся в герметичных баночках, на стеллажах с круглосуточным освещением). На этой стадии меристемные растения можно поместить на хранение в холодильник на несколько месяцев. Для некоторых культур это даже является положительным моментом – например, для микроклональной сирени, которая после этого лучше развивается и идёт в рост.

Компания «Микроклон» осуществляет поставки размноженных культур в герметичных пластиковых коробочках по 20 штук растений размером несколько сантиметров, находящихся на питательном агарозном геле. Такие приобретенные микроклональные растения в коробочке можно держать до 10 дней (это крайний срок), оптимально 3-7 дней.

Для дальнейшего выращивания меристемных растений необходима процедура адаптации, во время которой должны произойти фундаментальные физиологические перестройки. Меристемные растения надо «приучить» к «растительному» образу жизни и перестроить весь их обмен веществ. Размноженные микроклонально растения привыкли не фотосинтезировать, а получать углеводы из питательной среды (фотосинтез невозможен при всём желании, т.к. меристемные растения находятся в замкнутом объёме без доступа строительного сырья – углекислого газа из окружающей среды). Корни у меристемных растений толстые, похожие на спички, и не имеют всасывающих волосков. Ввиду 100%-ной влажности среды, на листьях полностью открыты устьица, а листовые пластинки не имеют воскового слоя.

Несмотря на всю фундаментальность поставленных задач, инструментально это достигается очень просто – растения помещают в условия со стабильной температурой (без сквозняков!), достаточным освещением (для фотосинтеза) и постепенно уменьшают влажность среды. Для начала полученные меристемные растения пересаживают. Растения берут пинцетом и осторожно и тщательно отмывают корни водой комнатной температуры от агара (А.Д. заранее ставит несколько кювет с водой и последовательно промывает в них корни). Это необходимо, т.к. иначе агар будет служить замечательной питательной средой для патогенных микроорганизмов. Если при отмывке случайно отломили корешок – не беда (т.к. он всё равно практически не функционален), растение отрастит новый, просто срок адаптации увеличится на 2-3 дня. Высадку проводят в кассеты, в торфяные таблетки диаметром 33 мм или кокосовые диаметром 30 мм. Кассеты ставят на стеллаж с освещением. Специальных процедур предпосадочной стерилизации стеллажей А.Д. за три года пока не применял, т.е. «проблема стерилизации на этом этапе не стоит» (если что, можно применять методы по аналогии с теплицами). Стеллаж накрывают полиэтиленовой плёнкой (100% влажность), потом плёнку начинают чуть приоткрывать на некоторое время, затем открывают всё больше и больше, и наконец снимают совсем. Весь процесс адаптации занимает максимум 4 недели, в среднем 2-3. Самые ответственные и сложные – первые дни адаптации. Лучше приживаются породы, которые ближе к древесным – сирень, алыча и пр., более ранимы породы ближе к травянистым, например, актинидия, при промывке стараться не намочить листья. Эта разница в адаптации в первые 2-3 дня, потом все растения нормально развиваются, если «зацепились».

Полив под корень не применяют. Под кассеты подкладывают капиллярный мат (самодельный: сложенный втрое нетканый материал, накрытый сверху цельным, т.е в 2 слоя ткани, «синтетическим» мешком из-под сахара), который увлажняют не чаще одного раза в сутки – влага из него через отверстия в кассете поступает к растениям. Также периодически опрыскивают растения, в том числе растворами комплексных удобрений в качестве подкормки. Подкормки комплексными удобрениями по листьям можно начинать с четвёртого дня адаптации, концентрацию берут поменьше, но обрабатывают почаще (1, затем 2 раза в неделю). При дальнейшем доращивании растений развитие корневой системы достигается перевалкой, проводимой несколько раз во всё большие по объёму горшки. Есть пока не решённая проблема с тем, что корни через отверстия в горшках проникают в капиллярный мат. В горшках также неравномерно развивается корневая система (закручивается по внутренней поверхности горшка), даже при периодической перевалке. Очень хороши горшки AirPot, но они довольно дорогие, для массового производства их использование слишком накладно.

В сотрудничестве с Компанией «Микроклон» А.Д. массово размножает довольно много декоративных культур, из плодово-ягодных – землянику, малину, ежевику, виноград, один сорт крыжовника, приступили к вопросу микроклонального размножения 2 сортов яблони, есть планы по абрикосу. По личным наблюдениям А.Д., увеличения урожайности у микроклонально размноженных ягодных культур не наблюдается (т.е. она не превышает максимальную для сорта). Однако есть очень много других плюсов. Меристемное растение как бы «обнуляет счётчик», биологически оно является ювенильным, поэтому растёт и развивается очень энергично, но в то же время ведёт себя как взрослое. Так, ремонтантные сорта малины, поставленные на адаптацию микроскопическими растениями в январе – в сентябре уже с плодами. У ежевики за аналогичные сроки плеть вырастает до 1,2 м. К достоинствам технологии относится также то, что при отработанной методике можно быстро и практически в неограниченных количествах размножить ценное растение, возникший новый клон и т.д. Полученные по технологии in vitro растения впоследствии легче размножаются зелёными черенками, т.е. лучше укореняются (из личного опыта А.Д.). Микроклональное размножение позволяет питомниководам продуктивно использовать зимний период.

Не все культуры успешно размножаются микрочеренкованием, но их круг всё равно шире, чем культур, хорошо размножаемых обычным зелёным черенкованием. Проблемы возникают, в частности, с культурами, которые сильно «фенолят» – выделяют корнями в субстрат фенольные соединения, что приводит к отравлению самих меристемных растений, находящихся в замкнутой системе. Очень тяжело вводить в меристемную культуру хвойные, орехоплодные, луковичные. В целом для каждой культуры надо подбирать свои особенности технологии, что может потребовать разного количества времени и усилий. Также приходится подбирать свои условия и для микроклонального размножения разных сортов в рамках одной культуры. Поэтому сортимент введённых в меристемную культуру плодово-ягодных растений пока не очень велик.

К микроклональному размножению часто высказывают упрёк, что оно приводит к мутациям у получаемых растений. Соматические мутации возможны (из-за повышенного гормонального фона), но реально они возникают не так часто, более того, в «Микроклоне» такие мутанты стараются выявлять и оставляют себе для исследований (на предмет получения более хозяйственно-ценных клонов). Действительно реальная проблема есть с сортами, которые являются химерами (например, сорт сирени «Сенсация»). В результате их размножения in vitro действительно часто наблюдается расхимеривание у части растений. Но это максимум 10%, при этом нормальные фирмы для таких случаев специально увеличивают поставляемую заказчику партию меристемных растений (скажем, при заказе на 100 штук выращивают 105).

В целом А.Д. эта технология очень нравится, в планах расширение набора выращиваемых меристемных культур и сортов и продолжение наблюдений. В частности, пока открыт вопрос, не изменяется ли скороплодность плодовых культур при микроклональном размножении. Также интересно посмотреть, будет ли влиять выращивание деревьев на своих корнях на вкусовые качества плодов (в трудах Бербанка и Мичурина есть сведения о положительном влиянии корнесобственности).

Культивирование вирусов. Питательные среды, применяемые для культивирования клеточных культур. Первичные, перевиваемые и диплоидные культуры клеток

Культивирование вирусов — выращивание вирусов в искусственных условиях.

Гальтье впервые осуществил в 1879 г. культивирование вируса бешенства, заразив кролика мозгом больной собаки. Способность вируса вакцины (коровьей оспы) репродуцироваться в тканевой культуре была доказана Паркером и Наем в 1925 г. В 1931 г. Вудрафф и Э. Гудпасчер показали возможность культивирование вирусов на хорион-аллантоисной оболочке эмбрионов кур (вирус оспы птиц).

Методы культивирования:

• На лабораторных животных

• В куриных эмбрионах

• В тканевых культурах

Клеточная культура – система клеток, получаемая из ткани, находящаяся в виде слоя клеток, прикрепленных к стеклу, или в виде суспензии. Подразделяются на:

1) Первичные культуры – могут быть получены практически из любого органа (почки, легкие, кожа, тимус), однако даже при систематической смене питательной среды существуют лишь до первого пересева.

2) Стабильные (перевиваемые) линии – полностью адаптированные к существованию вне организма; их получают из нормальных и раковых тканей; размножаются неограниченно долгое время. Бывают 2 типов:

а) Нормальные клетки. В качестве стабильной культуры используют почки барана (ПКБ) и сердце обезьяны циномольгус (СОЦ);

б) Опухолевые клетки. В качестве опухолевых используют культуру клеток Hela — рак шейки матки, Hep-1 — эпидермоидный рак гортани, Дейтройт 6 — костный мозг больного раком легкого.

3) Диплоидные (эмбриональные) культуры – получаемые из эмбриональных тканей человека и животных, сохраняющие диплоидный набор хромосом до 50 пересевов.

Наиболее практическое применение получили однослойные культуры первично-трипсинизированных и перевиваемых линий клеток.

Приготовление первичных (трипсинизированные) культур клеток. Берется орган → разрушается межклеточная ткань и происходит разобщение клеток путём воздействия на ткань протеолитических ферментов (трипсина, панкреатина) для последующего получения монослоя клеток на стекле.

В питательной среде должен присутствовать необходимый набор из неорганических ионов, аминокислот и витаминов. Различают искусственные (полусинтетические и синтетические) и естественные питательные среды.

Естественные питательные среды — это биологические жидкости (сыворотка крови, эмбриональный экстракт, асцитическая жидкость, коровья амниотическая жидкость, тканевые экстракты и др.). Питательные среды из естественных компонентов применяют редко, только для выращивания вновь изолированных тканей в начале культивирования и для поддержания очень прихотливых тканей животных.

Полусинтетические питательные среды представляют собой естественные среды, подверженные первичной ферментативной обработке. К таким средам относят гемогидролизаты, гидролизат лактальбумина, аминопептид и др.

Лучшими средами для культивирования культуры клеток являются синтетические питательные среды: 199 (содержит 60 компонентов: 10 аминокислот, 17 витаминов, 8 минеральных солей, 10 компонентов, входящих в состав нуклеиновых кислот и др.), Игла, Хенкса, Эрла (эти среды имеют аминокислоты, витамины, глюкозу, минеральные соли). Смена питательной среды проводится через 2-3 дня.

В зависимости от назначения среды подразделяются на: ростовые и поддерживающие. Ростовые применяются в первой фазе культивирования клеток, когда необходимо стимулировать клетки на максимально ускоренный рост и размножение. Они богаты питательными веществами, что способствует активному размножению клеток. Поддерживающие применяют во второй фазе культивирования клеток после заражения культуры клеток вирусами. Они поддерживают жизнеспособность клеток.

О наличии вируса в зараженной культуре клеток можно судить по цитопатическому действию (ЦПД) – это патологические изменения морфологии клеток, вплоть до их гибели, возникающие в результате репродукции вирусов, и наблюдаемые под микроскопом. Проявления ЦПД:

1. Дегенерация клеток (наблюдаются округления, изменения формы, разрушения).

2. Появление включений (Липшются – вирус герпеса; Гварниери – вирус натуральной оспы) и телец Бабеша-Негри – вирус бешенства).

3. Разрушение пласта клеток (парамиксовирусы).

4. Образование гигантских многоядерных клеток — симпластов (вирус кори).

5. Образование «негативных колоний», или «бляшкообразование» – ограниченные участки разрушенных вирусами клеток (дегенеративных клеток) в сплошном монослое культуре клеток. Они видны невооруженным глазом в виде светлых пятен на фоне окрашенного монослоя живых клеток. Добавление агара в питательную среду ограничивает распространение вирусов по всему монослою после выхода их из разрушенной клетки и обеспечивает взаимодействие вирусов только с соседними клетками. Каждая «бляшка» образуется потомством одного вириона. Титр вируса выражают числом бляшкообразующих единиц (БОЕ) в 1 мл.

Основные методы индикации вирусов в культуре тканей:

а. “+” гемагглютинация. Реакция гемагглютинации – склеивание эритроцитов при добавлении вирусосодержащего материала (есть вирус – эритроциты оседают в виде “зонтика”; нет вируса – в виде “диска”).

б. “+” гемадсорбция. Реакция гемадсорбции – адсорбция эритроцитов на поверхности пораженных вирусом клеток и образуют характерные скопления (вирус гриппа вызывает агглютинацию эритроцитов островкового типа).

в. Реакция нейтрализации вирусов в культуре тканей.

г. Цветная реакция Солка — основана на изменении цвета питательной среды. В результате жизнедеятельности клетки в питательную среду выделяются продукты клеточного метаболизма и происходит сдвиг рН в кислую сторону, о чем свидетельствует изменение цвета среды из красного в желтый. Если вирус присутствует и реплицируется в культуре, то вследствие разрушающего действия вируса клетки дегенерируются (разрушаются, т.е. их нет), и подавляется их метаболизм, т.е. цвет среды неизменяется.

Типы питательных сред и обзор их составов

В зависимости от вида растений необходимо испытывать как твердые (агаризованные), так и жидкие питательные среды. Иногда жидкие среды имеют преимущество, так как обеспечивают большую подвижность трофических элементов. Например, при размножении роз более успешным было культивирование побегов на двухслойной питательной среде: нижний слой – агаризованный, верхний – жидкий. На эффективность размножения могут также влиять расположение экспланта (горизонтальное или вертикальное), тип пробок (ватные, пластмассовые, стеклянные, металлические и т.д.), а также соотношение объема эксплантов и количества питательной среды для оптимального освещения и газообмена эксплантов.

Читать еще:  Можно ли в одном парнике выращивать огурцы и помидоры?

Состав питательной среды необходимо подбирать для каждого вида растений. На микроклональное размножение влияют гормоны, минеральные соли, витамины и углеводы. При размножении in vitro часто используют среды Мурасиге и Скуга, Гамборга, Хеллера и другие. Обычно используют среду Мурасиге–Скуга (MS), которая содержит много неорганического азота, что стимулирует процессы органогенеза и соматического эмбриогенеза. Вопрос оптимального соотношения NH4 — NO3 остается открытым, так как литературные данные весьма противоречивы и универсального рецепта для всех видов растений нет. В качестве источника углеродного питания используют различные углеводы типа сахарозы, глюкозы, фруктозы, галактозы. Разные культуры требуют различной концентрации углеводов на разных этапах микроклонального размножения.

Компоненты среды для выращивания растительных клеток и тканей можно разделить на 6 основных групп, что обычно отражает порядок приготовления концентрированных маточных растворов: макроэлементы, микроэлементы, источники железа, витамины, источники углерода, фитогормоны.

Основой для всех питательных сред для культивирования растительных эксплантов является смесь минеральных солей. Это соединения азота в виде нитратов, нитритов, солей аммония; фосфора – в виде фосфатов; серы – в виде сульфатов; а также растворимых солей К+, Na+, Са++, Мg++. Железо используется в виде хелатов [FeО4 или Fe2O4 + ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота) или её натриевая соль Na ЭДТА (трилон Б)] – наиболее доступной форме для усвоения растительными тканями.

Азот, фосфор, сера входят в состав органических соединений: белков, жиров, нуклеиновых кислот. Железо, цинк, марганец, молибден, кобальт в сочетании с порфиринами образуют макромолекулы пигментов фотосинтеза (хлорофилла), окислительно-восстановительных ферментов (каталазы, пероксидазы, полифенолоксидазы). Следовательно, все эти соединения выполняют в клетках и тканях структурную функцию. В то же время ионы К+, Na+, Са++, Cl –, Н + необходимы для регуляции pH среды и поддержания физиологических градиентов клеток (тургора, осмотического давления, полярности).

В качестве источника углерода для биологических макромолекул, а также при культивировании гетеротрофных тканей (каллусов и суспензий) в питательные среды добавляют углеводы в концентрации 20-60 г/л. Обычно это дисахариды (сахароза), моносахариды (гексозы: глюкоза и фруктоза, пентозы: ксилоза и другие). Полисахариды в питательных средах практически не используются. Только некоторые типы тканей (опухолевые), содержащие гидролитические ферменты, выращивают на средах с крахмалом, рафинозой, целлобиозой.

Для стимуляции биохимических реакций в клетке используют биологиче-ские катализаторы – витамины группы В (В1, В6, В12), С (аскорбиновую кислоту), РР (никотиновую кислоту), мезоинозит.

Тиамин (В1) входит в состав пируватдекарбоксилазы, участвует в превращениях углеводов. Тиаминпирофосфат входит в состав ферментов окислительного декарбоксилирования кетокислот (пировиноградной и кетоглутаровой), является коферментом транскетолазы.

Пиридоксин (В6) в виде фосфорнркислого эфира входит в состав ферментов декарбоксилирования и переаминирования аминокислот.

Никотиновая кислота (РР) в виде амида входит в состав дегидрогеназ НАД и НАДФ, катализирующих донорно-акцепторную цепь Н+ (отнятие Н+ от молекул органических веществ).

Для управления процессами формообразования в культуре тканей необходимы биологические регуляторы роста и развития – фитогормоны. Эти вещества влияют на дифференциацию и дедифференциацию клеток и тканей, инициируют гистогенез, индуцируют деление и растяжение клеток, участвуют в процессах старения и созревания, либо стимулируют, либо ингибируют рост и развитие клеточных культур, обуславливают формирование пола. В биотехнологических исследованиях чаще используют гормоны, стимулирующие рост и развитие: ауксины, цитокинины, гиббереллины.

Ауксины: ИУК – индолил-3-уксусная кислота, ИМК – индолил-3-масляная кислота, НУК – нафтилуксусная кислота, 2,4-Д – 2,4-дихлорфенокси-уксусная кислота.

Цитокинины: кинетин – 6-фурфуриламинопурин, зеатин, NN-дифенил-мочевина, 6-БАП – 6-бензиламинопурин.

Гиббереллины: гиберрелловая кислота.

В качестве биологических добавок для индукции первичного каллуса можно использовать растительные экстракты (10-15 % от общего объёма среды): кокосовое молоко (жидкий эндосперм кокосового ореха), вытяжки из незрелых зерновок кукурузы (лучше в период молочной спелости), которые содержат цитокинины – кинетин и зеатин (6-ти замещенные аминопурины) и NN-дифенилмочевину.

В культуре in vitro применяют жидкие и агаризованные (твердые) среды. Жидкие среды используются для культивирования суспензий, каллусов, изолированных органов и тканей, растений-регенерантов. При этом для поддержания эксплантов в пробирки со средой помещают специальные мостики-поддержки из фильтровальной бумаги или синтетических пористых материалов.

Агаризованные среды готовят на основе агар-агара – полисахарида, входящего в состав морских водорослей, который образует с водой гель при pH 5,6-6,0. Иногда в качестве уплотнителя и заменителя агар-агара используют полиакриламидные гели (биогели) P10 и P200.

Для искусственных питательных сред растворы макро- и микросолей готовят заранее и используют многократно. Это маточные (концентрированные) растворы. Их хранят в специальных условиях: макро- и микросоли в холодильнике в сосудах с притертыми пробками при 0…+4 о С; витамины, фитогормоны, ферменты, растительные экстракты – при -20 о С в небольших по 5-10 мл сосудах с пробками (пеницилловые флаконы).

Маточные растворы макросолей обычно превосходят рабочие по концентрации в 10-40 раз, микросолей – в 100-1000 раз, витаминов – в 1000 раз.

Растворы фитогормонов желательно готовить непосредственно перед работой со средами.

Для приготовления маточного раствора макро- и микросолей каждую соль растворяют в отдельном стаканчике при нагревании, затем сливают и доводят до нужного объема. В охлажденную смесь микросолей последним добавляют раствор солей молибдена, а в макросоли – раствор солей магния (для предотвращения выпадения осадка).

Маточные растворы хлористого кальция и хелата железа (сернокислое железо + ЭДТА, либо Na ЭДТА – трилон Б) готовят и хранят отдельно от других солей.

Концентрированные растворы витаминов готовят следующим образом: 10-кратные навески растворяют в 10 мл дистиллированной воды каждый отдельно.

Фитогормоны – это вещества, которые плохо растворяются в воде. Поэтому предварительно 100 мг вещества растворяют в небольших количествах (0,5-2,0 мл) спирта (ауксины, гиббереллины), 0,5-1 н HCl или КОН (цитокинины), затем подогревают до полного растворения (кроме абсцизовой кислоты и кинетина) и доводят до 100 мл объема (1 мл содержит 1 мг вещества).

Таблица 1

Прописи основных питательных сред используемых при микроклональном размножении растений

Раздел «Культуры растительных клеток»

Клеточная селекция

Методы клеточной селеции

Одно из направлений клеточных технологий — это использование их в селекции, которое облегчает и ускоряет традиционный селекционный процесс в создании новых форм и сортов растений. Существующие методы культивирования изолированных клеток и тканей in vitro условно можно разделить на две группы.

Первая группа — это вспомогательные технологии, которые не подменяют обычную селекцию, а служат ей. К ним можно отнести: оплодотворение in vitro (преодоление прогамной несовместимости), культивирование семяпочек и незрелых гибридных зародышей (преодоление постгамной несовместимости), получение гаплоидов путем культивирования пыльников и микроспор, криосохранение изолированных клеток, тканей и органов, клональное микроразмножение отдаленных гибридов.

Вторая группа методов ведет к самостоятельному, независимому от традиционных методов селекции, получению новых форм и сортов растений: клеточная селекция с использованием каллусной ткани, соматическая гибридизация (слияние изолированных протопластов и получение неполовых гибридов), применение методов генной инженерии.

В отдаленной гибридизации находят применение такие методы культуры изолированных тканей, как оплодотворение in vitro, эмбриокультура (выращивание изолированных зародышей на искусственных питательных средах), клональное микроразмножение ценных гибридов, а также получение гаплоидов in vitro и криосохранение.

Оплодотворение in vitro (преодоление прогамной несовместимости) проводится в том случае, когда невозможно осуществить оплодотворение между выбранными парами в естественных условиях. Это вызвано несколькими причинами: 1) физиологические (несоответствие во времени созревания пыльцы и т. д.); 2) морфологические (короткая пыльцевая трубка или блокирование роста ее на раз­ных этапах развития и т. д.).

Оплодотворение in vitro можно осуществить двумя способами: а) культивирование на искусственной агаризованной питательной среде завязи с нанесенной на нее готовой пыльцой; б) завязь вскрывается и на питатель­ную среду переносятся кусочки плаценты с семяпочками, вблизи которых или непосредственно на ткани плаценты культивируется готовая пыльца. Визуально определить, прошло оплодотворение in vitro или нет, можно по быстро увеличивающимся в размерах семяпочкам. Сформировавшийся зародыш, как правило, не переходит в состояние покоя, а сразу прорастает и дает начало гибридному поколению. Плацентарное оплодотворение in vitro позволило преодолеть несовместимость в скре­щивании сортов культурного табака N. tabacum с дикими видами N. rosulata и N. debneyi и сделало возможным получение межвидовых гибридов табака в опытах М.Ф. Терновского и др. (1976), Шинкаревой (1986).

Постгамная несовместимость при отдаленной гибридизации возникает после оплодотворения. Часто при этом образуются щуплые невсхожие семена. Причиной может быть расхождение во времени развития зародыша и эндосперма. Из-за слабого развития эндосперма зародыш бывает неспособен к нормальному прорастанию. В таких случаях из зрелой щуплой зерновки изолируют зародыш и выращивают его в питательной среде.

Выращивание зародышей в искусственной питательной среде называется эмбриокультурой. Среда для выращивания зрелого зародыша может быть простой, без добавок физиологически активных веществ (например, среда Уайта) или любая другая, содержащая минеральные соли и сахарозу. При более отдаленных скрещиваниях нарушения в развитии зародыша могут наблюдаться уже на ранних этапах, что выражается в отсутствии дифференцировки, замедленном росте. В этом случае культура зародыша состоит из двух этапов — эмбрионального роста зародыша, во время которого продолжается его дифференцировка, и прорастания подросшего зародыша. Для первого этапа требуется более сложная по составу среда с повышенным содержанием сахарозы, с добавками различных аминокислот, витаминов и гормонов.

Применение эмбриокультуры в селекции приобретает в последнее время большое значение для получения отдаленных гибридов зерновых, злаковых и других сельскохозяйственных культур. Показана возможность увеличения выхода пшенично-ржаных гибридов путем доращивания незрелых зародышей, а также использования эмбриокультуры для преодоления постгамной несовместимости при гибридизации пшеницы с колосняком.

Метод эмбриокультуры находит все более широкое применение в межвидовой гибридизации овощных растений. Для лука разработаны приемы выращивания in vitro абортивных зародышей от гибридных семян с разных этапов эмбриогенеза, выращивание зародышей от частично фертильных межвидовых гибридов. Культура изолированных зародышей используется в селекции томатов и других овощных растений.

Исследована гормональная регуляция роста и развития зародышей томата in vitro . Обсуждается возможность применения эмбриокультуры для получения отдаленных гибридов подсолнечника, изучаются факторы, контролирующие рост и развитие in vitro зародышей подсолнечника, выделенных в разные сроки после опыления.

Культура изолированных зародышей как вспомогательный метод при отдаленной гибридизации применяется не только для преодоления постгамной несовместимости, но также с целью микроразмножения ценных гибридов. В этом случае микроразмножение идет путем каллусогенеза, индукции морфогенеза и получения растений-регенерантов из каллусной ткани. Техника клонирования незрелых зародышей позволяет размножать ценные генотипы растений на ранних стадиях жизненного цикла. Еще одна возможность применения культуры зародышей — использование ее в клеточной селекции.

На искусственных питательных средах можно выращивать

7.2. Методы лабораторного культивирования водорослей (М. И. Радченко, Н. М. Масюк)

Метод культур все шире используют в практике таксономических [195, 639], флористических [85], гидробиологических [294] работ. Наличие чистых культур — необходимая предпосылка успешного физиолого-биохимического, цитологического и генетического изучения микроскопических водорослей.

Собранный в природе живой материал служит источником получения смешанных и чистых лабораторных культур водорослей. Исходный материал, помещенный в колбе на северное окно лаборатории, может сохраняться длительное время при периодическом добавлении (в меру подсыхания) воды из исходного местообитания, стерильной водопроводной воды или подходящей питательной среды, имеющих активную реакцию (pH), как в исходной среде. Такие смешанные культуры могут быть источником живого материала в качестве контроля при изучении фиксированных формалином проб. Однако, поскольку в таких культурах присутствует смесь разных видов, которые могут вытеснять друг друга, для систематических целей желательно иметь чистые культуры исследуемых объектов.

Для выделения монадных форм и стадий обычно используют их положительный фототаксис, благодаря которому подвижные организмы скапливаются на освещенной стороне сосуда (капли), где их можно собрать с помощью пипетки. Нейстонные водоросли и синезеленые, обладающие газовыми вакуолями, отделяют от других водорослей центрифугированием, в процессе которого они скапливаются в верхних слоях жидкости. Чистую культуру некоторых видов водорослей можно получить из их покоящихся клеток (зигот, акинет, спор, цист), подвергая исходный материал воздействию экстремальных факторов (высушивая, замораживая, нагревая в термостате), разрушающих сопутствующие организмы, которые не образуют покоящихся стадий.

Для выделения отдельных организмов широко используют пипеточный метод — отлавливание единичных клеток, колонии или нитей с помощью стерильной пипетки Пастера с тонко оттянутым длинным концом под бинокулярной лупой или при малых увеличениях микроскопа. Водоросли, отловленные благодаря всасывающей силе капилляра, последовательно переносят из одной капли стерильного питательного раствора в другую, пока в капле не останется искомая водоросль без посторонних примесей, после чего ее переносят в пробирку со стерильной питательной средой и выставляют на рассеянный свет, искусственный или естественный (этот метод в отдельных случаях позволяет избавиться не только от посторонних видов водорослей, но и от сопутствующих бактерий).

Более удобным является метод агаровых пластинок. Для этой цели используют агаризованные питательные среды, содержащие 0,5-2% агар-агара. Среды, содержащие меньше 0,5% агар-агара, наиболее пригодны для изоляции нежных жгутиковых организмов, не обладающих плотными клеточными покровами. На поверхность агаровой пластинки в чашке Петри диаметром 9 см равномерно наносят 0,1 мл суспензии водорослей со средней плотностью 1 клетка в 1 мм 3 . На одни сутки чашки Петри помещают на рассеянный дневной свет (окно с северной стороны), а затем переносят на осветительную установку с люминесцентными лампами (освещенность около 2 тыс. лк). Отдельные колонии, выросшие на поверхности агаровой пластинки, снимают (желательно с кусочками агаровой среды) стерильными инструментами (пипеткой, препаровальной иглой, ланцетом и др.) и вносят в пробирки с жидкой питательной средой. Двукратное повторение этой процедуры позволяет не только избавиться от посторонних видов водорослей, но и получить клоповые культуры [131].

Хотя для целей систематики нет надобности в получении бактериально чистых (аксенических) культур (поскольку альгологически чистые культуры более близки к естественным условиям обитания водорослей), однако при проведении ряда физиолого-биохимических исследований возникает необходимость очистки водорослей от сопутствующих бактерий. Аксенические культуры водорослей получают с помощью антибиотиков, ультрафиолетового облучения или путем многократной проводки через стерильные агаризованные питательные среды с примесью органических веществ, способствующих проявлению бактериального загрязнения [294, 639]. Следует иметь в виду, что применение антибиотиков и ультрафиолетового облучения, оказывающих мутагенное действие, может вызвать необратимые генетические изменения изучаемой культуры.

Среды, рекомендуемые для искусственного культивирования водорослей, чрезвычайно разнообразны. Выбор среды зависит от специфики культивируемого объекта и целей выращивания. Бывают жидкие среды (питательные растворы) и твердые (агаризованные). Первые используют для получения биомассы водорослей, необходимой для морфологических, цитологических, физиолого-биохимических и других исследований; вторые — для хранения коллекционных (музейных) культур * .

* ( Способы хранения коллекционных культур описаны в разделе 7.3)

Большинство водорослей хорошо развивается на минеральных средах, некоторые нуждаются в добавках органических веществ, которые служат источником элементов питания, витаминов и других физиологически активных веществ. Питательные среды содержат основные биогенные элементы (N, P, S, Mg, K, Ca) и микроэлементы (Fe, Mn, Cu, Mo, Br, Zn и др.). Источником углерода служит растворенный в воде углекислый газ, запасы которого постоянно пополняются из воздуха, а также за счет его выделения водорослями в процессе дыхания или внесения в среду карбонатов и бикарбонатов. Чтобы железо и другие микроэлементы не выпадали в осадок, в среды добавляют хелатирующие соединения — органические вещества, образующие с ионами металлов устойчивые комплексные соединения в форме, доступной для питания растений, например, этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА) или ее соли.

В качестве источника органических веществ иногда добавляют почвенную вытяжку. Существует много разных методов приготовления почвенной вытяжки. Например, Ф. Гиндак [639] рекомендует 1 часть почвы и 1 часть воды кипятить в течение 1 ч, настоять сутки, снова кипятить 1 ч, охладить, отфильтровать и фильтрат простерилизовать в автоклаве. Согласно рекомендации Э. А. III тиной [85], 1 весовую часть воздушно-сухой просеянной почвы в течение 5 мин взбалтывают с 4 частями воды, фильтруют и стерилизуют в автоклаве. Кроме почвенной вытяжки в качестве источников органических веществ добавляют пептон, глюкозу, сахарозу, аминокислоты, витамины и другие соединения.

Для приготовления питательных растворов используют дистиллированную воду, полученную из стеклянного перегонного аппарата, или простер и лизованную водопроводную воду, а также химические реактивы с достаточно высокой степенью очистки (чда).

Чтобы избежать образования осадка в питательной среде, ее компоненты лучше готовить отдельно в небольших объемах воды. Полученные растворы после стерилизации и охлаждения постепенно смешивают в необходимом объеме воды, добавляя их в той последовательности, в которой они записаны во взятом рецепте, соблюдая при этом условия стерильности. В первую очередь это касается растворов микроэлементов, фосфатов, бикарбонатов, квасцов.

Посуду и инструменты, предварительно тщательно вымытые, высушенные и завернутые в бумагу, стерилизуют и сушат в сушильном шкафу при 165-180°С в течение 2 ч. Стерилизацию раствора проводят в автоклаве сухим паром в течение 45-60 мин при давлении 9,8 ⋅ 10 2 ГПа. Среды, содержащие легко разрушающиеся органические вещества (сахара, витамины), стерилизуют при 4,9 ⋅ 10 2 ГПа 15-30 мин. Иногда применяют дробную стерилизацию текучим паром в 3-4 приема (через 2-3 суток) в аппарате Коха или в автоклаве.

Разнообразные прописи питательных сред, рекомендуемых для тех или иных групп водорослей, можно найти в многочисленных статьях и сводках [52, 175, 195, 294, 453, 639, 703]. Ниже приведены лишь некоторые из них.

Среда Киопа (г/л, применяется в разведениях 1/2, 1/4, 1/10, для зеленых водорослей):

Среда Прата (г/л, для хранения коллекции культур):

Среда Тамия (г/л, применяется в различных разведениях для зеленых водорослей):

голоса
Рейтинг статьи
Ссылка на основную публикацию
ВсеИнструменты
Adblock
detector